Receptory podobné Toll (TLRs), prirodzená imunita 
a alergický zápal

Toll-like Receptors (TLRs), Innate Immunity
and Allergic Inflammation

MIROSLAV FERENČÍK

SOUHRN
Začiatočné rozpoznanie mikróbov, ktoré vniknú do organizmu, sa zakladá na ich geneticky zakódovaných molekulových vzoroch patogénnosti (PAMPs), ktoré umožňujú odpovedať na mikróbnu inváziu ihneď, čiže ešte pred vznikom aktívnej špecifickej imunity. Táto odpoveď hostiteľa na infekciu a poranenie sa realizuje prostredníctvom neustále sa rozširujúcej skupiny receptorov patriacich do veľkorodiny receptorov pre interleukín-1 (IL-1Rs) a receptorov podobných Toll (TLRs). Členovia obidvoch týchto rodín obsahujú v cytoplamových častiach ich molekúl doménu TIR (Toll/IL-1R). Doteraz sa zistilo desať IL-1Rs (vrátane IL-1RI a IL-18R) a desať TLRs (TLR1 až TLR10). Exprimujú sa najmä na bunkách, ktoré sa nachádzajú na tkanivách prichádzajúcich do kontaktu s vonkajším prostredím. Aktivácia TLRs má za následok aktiváciu priamych antimikróbnych mechanizmov, ako súčasti prirodzenej imunity, expresiu kostimulačných molekúl a uvoľnenie cytokínov, ktoré regulujú adaptívnu imunitnú odpoveď. Prenos signálov cez tieto receptory môže zodpovedať aj za stimuláciu dozrievania imunitného systému a môže sa preto zúčastňovať na patogenéze alergických chorôb. Využitie poznatkov o TLRs sa pravdepodobne v budúcnosti bude dať preto využiť pri nových účinných postupoch liečby osobitne atopických chorôb. Genetické a vývojové variácie v expresii TLRs môžu ovplyvňovať individuálnu predispozíciu na infekcie v detskom veku a prispievať k zvýšenej citlivosti nielen na alergie, ale aj na zápalové a autoimunitné choroby.
Klíčová slova: TLRs, IL-1Rs, TIR doména, zápal, atopia, alergické choroby

SUMMARY
Initial recognition of microbes, as they enter the body, is based on germ line-encoded pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) to respond immediately to the microbial invasion before the development of active specific immunity. This host response to infection and injury is performed through an expanding group of receptors belonging to the superfamily of interleukin-1 receptors (IL-1Rs) and Toll-like receptors (TLRs). They both contain the Toll-IL-1 receptor (TIR) domain which occurs in the cytosolic region. So far, ten IL-1Rs (including IL-1RI and IL-18R) and ten TLRs (TLR1 to TLR10) have been revealed. They are predominatly expressed on cells at the interface of the body with the environment. The activation of TLRs leads to direct antimicrobial pathways, as a part of innate immunity, to the expression of co-stimulatory molecules and to the release of cytokines that instruct the adaptive immune response. Signalling via these receptors may be also responsible for driving the maturation of the adult immune system and therefore it may participate in the pathogenesis of allergic diseases. Exploitation of the TLR signalling will probably lead to novel effective therapies for these diseases. Genetic and developmental variations in the expression of TLRs may affect the individual predisposition to infections in childhood and may contribute to the increased susceptibility not only to allergies but to inflammatory and autoimmune diseases as well.
Key words: TLRs, IL-1Rs, TIR domain, inflammation, atopy, allergic diseases

Úvod

Pred tromi-štyrmi rokmi len pár imunológov a alergológov sa zaujímalo o receptory podobné Toll (TLRs). Dnes sa situácia zásadne zmenila. Ukázalo sa, že signály prenášané z mikroorganizmov prostredníctvom týchto receptorov zásadne ovplyvňujú nielen zápalové a iné imunitné procesy, ale sú nevyhnutné aj pre dozrievanie imunitného systému človeka a ostatných cicavcov. Významným spôsobom sa preto môžu zúčastňovať patogenézy alergických chorôb, najmä svojou účasťou pri navodení periférnej imunologickej tolerancie na potravinové a iné alergény. Vzhľadom na túto skutočnosť sa stávajú možnými terčami pre antialergickú liečbu. Cieľom tohto referátu je podať prehľad o štruktúre a biologických funkciách TLRs, ako aj ďalších príbuzných receptorov umožňujúcich prežívanie človeka a ostatných mnohobunkových organizmov v prostredí s obrovskoun prevahou rôznych mikróbov.

Prirodzená imunita – primárny predpoklad existencie mnohobunkových organizmov

Prvotné mnohobunkové organizmy, ktoré vznikli pred mnohými miliónmi rokov, museli za účelom svojho prežitia v prvom rade vytvoriť také vnútorné prostredie, v ktorom sa ich vlastné bunky mohli rozvíjať, ale ktoré súčasne bránilo existencii iných (exogénnych) organizmov. Túto úlohu splnili vytvorením mechanizmov, ktoré zabezpečovali integritu hostiteľa a likvidáciu invazívnych cudzích buniek. Dnes sa tieto mechanizmy označujú ako prirodzená alebo vrodená imunita. Už u najprimitívnejších mnohobunkových organizmov sa kladá z troch línií: 1) Fyzikálna prekážka (bariera), ktorú tvorí keratinizovaný epitel, mechanicky bráni preniknutiu exogénnych buniek, osobitne mikroorganizmov, do vnútorného prostredia hostiteľa. 2) Ak sa táto prekážka poškodí (napr. pri poranení), nastupuje druhá línia, ktorú tvoria antimikróbne peptidy. Tieto sú schopné zastaviť rast väčšiny potenciálne patogénnych mikroorganizmov. Antimikróbne peptidy sa tvoria konštitutívne na vnútroných epitelových povrchoch (dýchacie cesty, GIT). 3) Tretiu líniu obrany predstavujú bunky, ktoré sú schopné pohltiť a usmrtiť cudzie bunky (profesionálne fagocyty), prípadne ich poškodiť a usmrtiť bez fagocytózy (NK bunky). Tieto bunky produkujú viac typov cytotoxických látok, ktoré majú bezprostrednú výkonnú funkciu.

U stavovcov sa vytvoril systém rozpustných (protilátky) alebo na bunky viazaných receptorov (antigénové receptory na lymfocytoch), ktoré sú schopné špecificky rozpoznávať antigény vrátane patogénnych mikroorganizmov. Nenahraditeľnú pomoc im pri tom poskytujú bunky prezentujúce antigén, ktoré vznikli už pri vývoji mechanizmov prirodzenej imunity. Bez buniek, ako sú makrofágy alebo dendritové bunky, by nemohla existovať ani adaptívna (špecifická) imunitná odpoveď (13).

Mnohobunkové organizmy vrátane človeka a ostatných cicavcov musia existovať v „mori“ mikróbov. Preto prvotným predpokladom ich existencie je schopnosť rozlíšiť vlastné bunky od invadujúcich mikróbnych buniek. Mikróby mali možnosť sa rozvíjať podstatne dlhšiu dobu a preto na našej planéte existujú milióny ich rôznych druhov. Niektoré z nich sa s hostiteľom „spriatelili“ a žijú s ním v prospešnej symbióze alebo aspoň v tolerovateľnej koexistencii. Len menšia časť z nich je nepriateľská – patogénna a poškodzuje hostiteľa. Mikróby majú obrovskú schopnosť premeny svojich vlastností podľa podmienok ich životného prostredia. V systéme prirodzenej imunity sa preto musel vytvoriť súbor biosenzorov – receptorov schopných rozlišovať nielen vlastné bunky hostiteľa od buniek mikroorganizmov, ale rozlišovať aj medzi potenciálne patogénnymi a prospešnými mikróbnymi druhmi.

Vzhľadom na obrovské množstvo mikróbnych druhov nebol jednoducho na bunkách hostiteľa dostatočný priestor na umiestnenie receptorov špecificky rozpoznávajúcich každý mikróbny druh a rovnako nebol ani dostatočný priestor na zabudovanie ich genetickej informácie do genómovej DNA. Východisko z tejto zložitej situácie sa našlo v tom, že vznikli receptory, ktoré nerozpoznávajú na povrchu mikróbov ich jednotlivé špecifické molekuly, ale určitý súbor molekúl alebo ich súčasti, ktoré sú spoločné viacerým mikróbnym druhom a súčasne sú charakteristické pre ich patogénnosť. To sú molekulové vzory alebo motívy spojené s patogénom – PAMPs (pathogen-associated molecular patterns). Tieto motívy majú základnú úlohu v biológii invadujúcich mikróbnych agensov a nepodliehajú častým mutáciám. Majú preto relatívne konzervovanú štruktúru (32).

PAMPs sú ligandmi pre receptory rozpoznávajúce (patogénne) motívy – PRRs (pattern recognition receptors), ktoré sa nachádzajú na povrchu mnohých buniek hostiteľa (31).Gén pre prvý takýto receptor sa charakterizoval v genóme banánovej mušky (Drosophila melanogaster) a označil sa ako Toll. Má základnú úlohu v jej ontogenéze a antifungálnej rezistencii (39). Čoskoro sa zistilo, že homológ Toll – receptory podobné Toll (TLRs – Toll-like receptors) sa nachádzajú aj na leukocytoch človeka (41, 42). TLRs majú cytoplazmové domény homológne s rodinou receptorov pre interleukín-1 (IL-1Rs), podobné funkcie v mechanizmoch prirodzenej imunity a preto predstavujú jednu veľkorodinu IL-1R/TLR (15, 49, 52). V súčasnosti sa termínom PRRs označujú receptory, ktoré sú príbuzné TLRs (33). Takými sú najmä receptory sprostredkúvajúce fagocytózu.

Motívy spojené s patogénom – PAMPs

Za osobitne významné ľudské patogény sa pokladajú najmä štyri skupiny baktérií: Gram-negatívne (G-) a Gram-pozitívne (G+) baktérie, mykobaktérie a spirochéty (1). Tieto, ale aj ďalšie mikroorganizmy obsahujú viac súčastí, ktoré sú schopné aktivovať imunitnú odpoveď a možno ich charakterizovať ako PAMPs. Ich typickými predstaviteľmi sú: lipopolychacharid (LPS), peptidoglykány, lipoproteíny, kyselina lipoteichová, manány, glukány, lipoarabinomanán (LAM), lipopeptidy a baktériové DNA (tab. 1). Sú unikátne pre mikroorganizmy a chýbajú na bunkách hostiteľa. Ďalšie, ako proteíny teplotného šoku (osobitne Hsp60-65) a N-formylované peptidy môžu pochádzať nielen z mikróbov, ale aj z poškodených buniek hostiteľa. Preto sa uplatňujú aj v patogenéze autoimunitných a iných zápalových procesov.

Kľúčovým PAMP G- baktérií je LPS, zložitý glykolipidový komplex ich vonkajšej membrány. Jeho súčasťou je lipid A, ktorý má konzervovanú štruktúru v lipopolysacharidoch pochádzajúcich z rôznych druhov G- baktérií. Na lipid A sa viaže proteín viažúci lipopolychacharid – LPB (lipopolysaccharide-binding protein) a tento komplex sa nadväzuje na molekulu CD14 nachádzajúcu sa na povrchu buniek leukocytov a niektorých iných buniek. Dlho sa predpokladalo, že CD14 je receptorom pre LPS a ich interakcia má základnú signalizačnú funkciu pre biologické aktivity LPS (iniciácia a amplifikácia zápalovej odpovede, tvorby faktora nekrotizujúceho nádory – TNF a ďalších cytokínov s možnosťou vzniku endotoxínového šoku). Ukázalo sa však, že molekula CD14 je v cytoplazmovej membráne zakotvená prostredníctvom glykozyl-fosfatidylinozitolu, ktorý nie je spojený so žiadnym intracelulárnym signálnym mechanizmom a preto nemôže plnohodnotne aktivovať bunky imunitného systému. Dnes je dokázané, že kľúčovú úlohu pri signalizácii biologických aktivít, ktoré vlastní LPS, má jedna skupina receptorov podobných Toll – TLR4 (28, 37). Výžaduje však pri tom spoluprácu ďalšej molekuly MD-2, ktorá je spojená s intracelulárnou doménou TLR4 (3).

Baktériové lipoproteíny (BLPs) sú ďalšími účinnými stimulátormi zápalových odpovedí. Sú súčasťou vonkajších membrán všetkých eubaktérií. Na N-konci svojich molekúl majú cysteínovú jednotku modifikovanú lipidom, ktorá má zásadný význam pre ich biologickú aktivitu (27). Viažu sa podobne ako lipopeptidy, na dimérovú formu TLR2 (37).

Bunkové steny G+ baktérií obsahujú viac biologicky aktívnych molekúl, vrátane peptidoglykánov, kyseliny lipoteichovej a lipopeptidov, ktoré pôsobia ako PAMPs (27). Nadväzujú sa na heterodimérové receptory TLR1/TLR2 alebo TLR2/TLR6 (6, 37).

Lipoarabinomanan je základným stimulátorom buniek prirodzenej imunity nachádzajúcim sa v mykobaktériách. Pôsobí prostredníctvom receptora TLR1/TLR2 alebo diferenciačnej molekuly CD1.

DNA mnohých baktérií obsahuje úseky nemetylovaných CpG oligonukleotidov, ktoré bunky človeka a ostatných cicavcov rozpoznávajú prostredníctvom TLR9 ako účinné PAMPs (4, 11). Oligonukleotidy CpG obsahuje aj ľudská DNA, ale tieto sú na rozdiel od baktériových DNA zvyčajne metylované, preto ich TLR9 nerozpoznáva ako cudzie.

Typickými PAMPs kvasiniek, napr. kandíd, sú glukány, manány a manoproteíny (1).

Väčšina doteraz charakterizovaných ligandov pre TLRs má exogénny pôvod. V poslednom čase sa však ukazuje, že TLRs môžu aktivovať aj niektoré endogénne stimuly, ktoré prostredníctvom týchto receptorov regulujú zápalové a imunitné odpovede najmä na poškodené tkanivo (12). Takými stimulmi sú nekrotické bunky, proteíny teplotného šoku (Hsp60, Hsp70, GP96) alebo degradačné produkty proteoglykánov extracelulárneho matrixu. Uplatňujú sa pri tom TLR4 a TLR2. Napr. Hsp60 po väzbe na TLR4 môže vyvolať zápalovú odpoveď makrofágov (43). Pravda, Hsp 60 je aj súčasťou viacerých baktérií a preto môže mať aj exogénny pôvod.

Receptory rozpoznávajúce PAMPs

Bunky prirodzenej imunity majú dve kategórie receptorov rozpoznávajúcich motívy patogénnosti na mikroorganizmoch: tie, ktoré sprostredkúvajú fagocytózu a tie, ktoré aktivujú zápalové odpovede (32).

Fagocytóza patrí medzi fylogeneticky najkonzervovanejšie procesy. Plní dve základné funkcie: usmrtenie pohltených mikróbov vo fagolyzozómoch profesionálnych fagocytov (efektorová funkcia) a úprava antigénov na imunogénne fragmenty v bunkách prezentujúcich antigén (makrofágy, dendritové bunky), čím utvára základné premostenie medzi prirodzenou a adaptívnou imunitnou odpoveďou. Do skupiny receptorov sprostredkujúcich fagocytózu patria receptory pre Fc-domény imunoglobulínov (FcgRs), receptory pre baktérie opsonizované C3b zložkou komplementu (CR1, CR3 a CR4), ktoré sa nachádajú na neutrofiloch, monocytoch a tkanivových makrofágoch, ako aj skupina rôzne špecializovaných receptorov na makrofágoch, ako napr. manózový receptor alebo receptory pre pohlcovanie rôznych typov apoptózových buniek bez zápalovej odpovede (22).

Receptory, ktoré po väzbe PAMPs aktivujú zápalové odpovede, patria do dvoch rodín. Je to rodina receptorov podobných Toll (TLR) a rodina receptorov podobných receptoru pre IL-1 (IL1-R). Spoločne utvárajú veľkorodinu IL-1R/TLR. Členovia obidvoch rodín sa skladajú z transmembránových proteínov, ktoré majú homológne cytoplazmové domény, ale rozdielne extracelulárne domény (obr. 1).

Rodina IL-1R má doteraz 10 charakterizovaných členov, medzi ktoré patria dva receptory pre IL-1 (IL-1RI a IL-1RII) a receptor pre IL-18 (IL-18R). Vyskytujú sa formou komplexov s ich prídatnými (akcesórnymi) proteínmi (AcP). Ich extracelulárnu časť tvoria tri domény podobné imunoglobulínovým doménam (43, 50). Intracelulárna časť má konzervovanú doménu homológnu s rovnakou časťou TLRs. Označuje sa ako Toll/IL-1R (TIR) doména. Túto doménu, ktorá má kľúčovú úlohu pre prenose signálu do bunkového jadra, majú všetky TLRs a členy rodiny IL-1R s výnimkou IL-1R II. typu. IL-1RII nemá TIR-doménu a preto nie je schopný intracelulárne prenášať signál sprostredkovaný IL-1 (15, 17).

IL-1 patrí medzi najviac študované cytokíny s množstvom rôznych biologických účinkov. Nadväzuje sa na komplex IL-1RI a jeho akcesórneho proteínu (IL-1RAcP), čo je signálom na aktiváciu asi 100 génov, ktorých produkty sa zúčastňujú zápalovej odpovede. IL-1RI sa exprimuje na mnohých bunkách, kým expresia IL-18R nie je tak rozšírená. IL-18 je účinným induktorom IFN-g, stimuluje cytolytickú aktivitu cytotoxických T-lymfocytov a NK buniek a uľahčuje diferenciáciu T-lymfocytov na T_H1- alebo T_H2-fenotyp. Zúčastňuje sa na patogenéze chronických zápalových chorôb (2, 36, 51).

Ďalšími členmi rodiny IL-1R sú IL-1RAcP, IL-18RAcP, IL-1RAPL (IL-1 receptor accessory protein-like) – prídatný proteín podobný IL-1RAcP, T1/ST-2 a IL-1Rrp2. Receptory IL-18R a T1/ST-2 majú významnú úlohu pri polarizácii T-bunkových odpovedí. IL-18R je významným regulátorom T_HH1-buniek, kým T1/ST-2 reguluje vývoj T_H2-buniek (44). To naznačuje, že obidva receptory by sa mohli zúčastňovať na patogenéze alergickej astmy a iných atopických ochorení.

Doteraz sa charakterizovalo 10 rôznych TLRs, ktoré sa označujú TLR1 až TLR10. Všetky sú transmembránové proteíny, ktoré v cytoplazmovej časti majú TIR-domény, kým ich extracelulárne úseky sa skladajú z aminokyselinových sekvencií bohatých na lyzínové jednotky (obr. 1). Nachádzajú sa na bunkách hmyzu a ostatných bezstavovcov, vo vyšších rastlinách (len v cytoplazme) a na bunkách cicavcov. U človeka sa v najvyššom počte exprimujú v lymfatickom tkanive, osobitne na periférnych krvných leukocytoch (neutrofily, monocyty, B- a T-lymfocyty), tkanivových makrofágoch, dendritových bunkách a na iných bunkách, ktoré prichádzajú do priameho kontaktu s vonkajším prostredím, ako sú epitelové a endotelové bunky, prípadne adipocyty (37, 40, 48).

Nie všetky typy TLRs možno detegovať na všetkých uvedených druhoch buniek. Medzi najrozšírenejšie patria TLR1, TLR2 a TLR4, kým napr. TLR3 sa nachádza prevážne len na dendritových bunkách (DCs). Podľa expresie jednotlivých TLRs sa ľudské DCs dajú rozdeliť na dve subpopulácie. Tá, ktorá pochádza z myeloidnej (monocytovej) línie, exprimuje TLR1, 2, 4, 5 a 7, kým DCs z plazmocytovej línie exprimujú TLR7 a 9 (35).

TLRs sú vlastne unikátnymi biosenzormi, ktoré sú na povrchu buniek imunitného systému a buniek v bezprostrednom kontakte s vonkajším prostredím. Ich základnou úlohou je
• rozpoznanie prítomnosti patogénnych mikroorganizmov,
• navodenie antimikróbnej obrany, najmä prostredníctvom mechanizmov prirodzenej imunity (fagocytóza, zápal),
• uľahčenie adaptívnej imunitnej odpovede (indukcia tvorby cytokínov, aktivácia buniek prezentujúcich antigén) a
• s veľkou pravdepodobnosťou aj pomoc pri reparácii poškodeného tkaniva.

Okrem týchto vyslovene obranných funkcií TCRs však môžu iniciovať a potencovať aj poškodzujúci zápal a zúčastňovať sa na patogenéze viacerých chorôb (24, 50, 57). V poslednom čase sa predpokladá, že TLRs sa zúčastňujú aj opravných procesov napr. po koškodení tkaniva napr. následkom ischémie a následnej reperfúzie (12).

Ako je možné, že tak obrovské množstvo rôznych potenciálne patogénnych mikróbnych druhov dokáže rozpoznať len malý počet TLRs? Uľahčuje im to nielen existencia relatívne obmedzeného počtu typických znakov patogénnosti, ktoré sú si veľmi podobné na viacerých druhoch mikroorganizmov (PAMPs), ale aj rôzna špecifickosť jednotlivých TLRs a určité osobitosti ich štruktúry a prenosu rozpoznaných signálov.

Najširšiu špecifickosť má TLR2, ktorý je principiálnym receptorom rozpoznávajúcim PAMPs na G+ baktériách, vrátane peptidoglykánov, kyseliny lipoteichovej a lipoproteínov, ale aj lipopeptidov a lipoarabinomanánu mykobaktérií, glukánov a manánov kvasiniek a húb. Takúto rôznorodú špecifickosť umožňuje skutočnosť, že aktívnu rozpoznávaciu jednotku utvára TLR2 vo forme homo- alebo heterodiméru. Napr. peptidoglykány a niektoré lipoproteíny rozpoznáva heterodimér TLR2/TLR6, kým iné lipoproteíny, lipopeptidy a glykolipidy heterodimér TLR1/TLR2 a lipoproteíny ďalších mikróbnych druhov homodimér TLR2/TLR2 (45, 50). Okrem toho TLR2 je schopný odpovedať aj na endogénne signály sprostredkované Hsp60 alebo Hsp70 (4).

Na druhej strane TLR4, ktorého základnou funkciou je rozpoznávanie lipopolysacharidov G- baktérií, nevyžaduje na svoju aktivitu dimerizáciu s inou molekulou TLR. Je však pravdepodobné, že túto úlohu plní iný prídatný proteín MD-2, molekula CD14 alebo integrín CD11b/CD18 (CR3), ktoré pôsobia vlastne ako koreceptory. TLR4 sprostredkúva aj odpoveď na niektoré endogénne signály, ako je Hsp60, ktorý sa uvoľňuje z vlastných poškodených buniek, fibrinogén alebo oligosacharidy vznikajúce degradáciou hyalurónanu (4, 23, 48, 52).

TLR2 a TLR4 sa vo zvýšenej miere exprimujú vo fagozómovej membráne makrofágov, kde plnia rozdielne úlohy. TLR2 tu rozpoznáva G+ baktérie a kvasinky, kým TLR4 zodpovedá za rozpoznanie G- baktérií (58). Funkčná aktivita makrofágov po ligácii týchto dvoch rôznych receptorov nie je identická. Napr. ľudské alveolárne makrofágy, ktoré rozpoznali agonistov TLR2, zvyšujú len produkciu makrofágového zápalového proteínu MIP-1b, kým LPS po väzbe na TLR4 indukuje tvorbu poplachového zápalového cytokínu TNF a chemokínov MIP-1b a RANTES (34). Podobné rozdiely medzi týmito dvoma receptormi sa zistili aj pri ľudských dendritových bunkách. TLR2 sprostredkúva signál, ktorý preferuje vývin T_H2-bunkovej odpovede, kým TLR4 stimuluje T_H1-odpoveď (46). To znamená, že popri receptoroch IL-18R a T1/ST-2 sú TLR2 a TLR4 ďalšími receptormi veľkorodiny IL-1R/TLR, ktoré môžu regulovať vývoj subpopulácií T_H-lymfocytov a zasahovať tak do patogenézy alergických chorôb.

Na rozdiel od TLR2 a TLR4 majú TLR5 a TLR9 vysoký stupeň špecifickosti. Špecifickým ligandom TLR5 je flagelín, proteínová zložka baktériových bičíkov (25), kým pre TLR9 sú to nemetylované CpG oligodeoxynukleotidy baktériových DNA (26). Flagelín na rozdiel od iných PAMPs neobsahuje lipidovú ani sacharidovú súčasť, ale je čistým proteínom (57).

Nedávno sa ukázalo, že TLR3 rozpoznávajú dvojvláknovú vírusovú RNA (3) a polynukleotidy I:C (4).

Zatiaľ nie je známy ligand typu PAMPs pre TLR7. Na tento receptor sa však viažu niektoré farmaká, ako imidazochinolíny Imiquimod a Resiquimod, ktoré týmto mechanizmom indukujú tvorbu IFN-a a IL-12 a preto majú významné antivírusové (osobitne proti Papilloma vírusom) a protinádorové účinky. Prostredníctvom TLR7 pôsobia aj imunomodulátory loxoribín a bropirimín, ktoré zvyšujú NK aktivitu, proliferáciu B-lymfocytov a tvorbu cytokínov, najmä interferónov (3, 4, 30). To by mohlo naznačovať, že aj ďalšie imunomodulačné látky by mohli pôsobiť prostredníctvom TLRs.

K rozšíreniu špecifickostí TLRs prispieva skutočnosť, že na jednotlivých bunkách imunitného systému sa zvyčajne nachádza viac typov TLRs, ktoré môžu pôsobiť koordinovane a súčasne rozpoznávať dve alebo viac PAMPs na povrchu určitého mikróba, ako je to znázornené na obr. 2 (57).

Aby bunka hostiteľského organizmu mohla odpovedať aktiváciou fagocytózy alebo zápalovej odpovede na signál, ktorý príjme prostredníctvom receptorov veľkorodiny IL-1R/TLR, musí sa tento signál preniesť do bunkového jadra, kde aktivuje (zvyčajne prostredníctvom transkripčných faktorov) príslušné gény. Mechanizmus tohto prenosu je veľmi podobný pri všetkých členoch tejto veľkorodiny a schématicky je znázornený na obr. 3. Aktívne formy IL-1R alebo IL-18R sú ich diméry v komplexe s príslušnými akcesórnymi proteínmi IL-1RAcP alebo IL-18RAcP (44). V homodimére TLR4 funkciu prídatného proteínu plnia molekuly CD14 a MD-2, v heterodimére TLR2/TLR6 je to len molekula CD14 (57). Prítomnosť prídatných proteínov sa predpokladá aj v aktívnych ektomembránových komplexoch ostatných TLRs.

Mechanizmus intracelulárneho prenosu signálu začína konzervovaná TIR doména, na ktorú sa nadviaže adaptorová cytoplazmová molekula MyD88 taktiež obsahujúca TIR doménu (obr. 1). Tým sa aktivuje rodina serínovo treonínových kináz IRAK (IL-1R-associated kinase), ktoré postupnou aktiváciou faktora spojeného s receptorom pre TNF – TRAF6 (TNFR-associated factor), ďalších faktorov a kináz vyvolajú fosforyláciu inhibičného proteínu IkB, čo má za následok uvoľnenie a prenos nukleárneho (transkripčného) faktora NF-kB do jadra, kde aktivuje množstvo génov zúčastňujúcich sa zápalových a iných imunitných odpovedí. Okrem NF-kB sa pri tom aktivujú aj ďalšie kinázy, osobitne MAPKs (mitogénom aktivované proteínkinázy) a JNK (c-jun N-koncová kináza) (15, 53, 57).

Okrem adaptorovej molekuly MyD88 (myeloid differentiation 88) sa v cytoplazme buniek hostiteľa dokázala aj ďalšia molekula Tollip, ktorá sa môže nadviazať na TIR doménu IL-1R a aktivovať tak IRAK (16). Rovnakú funkciu však Tollip plní aj pri prenose signálu z TLR2 a TLR4 (57).

Zdá sa, že okrem aktivácie NF-kB interakciou MyD88>Tollip>IRAK môže existovať aj ďalšia aktivačná cesta, na ktorej pôsobí Rac1 (malý proteín viažúci GTP) a PI3-kináza (fosfatidylinozitol-3-OH kináza). Aktivačný komplex s Rac1 a PI3-kinázou utvárajú TLR1, 2 a 3, ale nie TLR4 alebo TLR5 (8). Nedávno sa identifikovali dve ďalšie molekuly TIRAP a LAP, ktoré špecificky reagujú s intracelulárnou doménou TLR4 a pravdepodobne sprostredkúvajú signalizáciu nezávislú od adaptorovej molekuly MyD88 (21, 29). Prostredníctvom TLRs sa aktivujú nielen gény, ktorých produktmi sú dôležité zápalové mediátory, ako TNF, IL-12 a viaceré chemokíny, ale zvyčajne aj tvorba antimikróbnych látok, ako je oxid dusnatý a ďalšie intermediáty dusíka (RNI) alebo reaktívne intermediáty kyslíka (ROI). Zvýšenú produkciu ROI a RNI však iniciujú iné receptory, ktoré pravdepodobne kooperujú s TLRs (57).

Funkcia TLRs pri alergických a iných chorobách

Genetické a vývojové variácie v expresii TLRs môžu ovplyvniť predispozíciu jedinca na infekcie a jeho citlivosť na neonatálne choroby, alergie a autoimunitné choroby (24). Aktivácia TLRs môže byť aj škodlivá a viesť ku tkanivovému poškodeniu, ako je tomu pri septickom šoku alebo stimulácii apoptózy (7). Na druhej strane v neprítomnosti infekcie môže systém TLRs uľahčovať pohltenie a likvidáciu apoptózových buniek bez zápalovej reakcie.

Predpokladá sa, že hlavnou príčinou atopických chorôb, ako je alergická astma alebo atopický ekzém, je nedostatočne regulovaná odpoveď subpopulácie pomocných T_H2-lymfocytov vyúsťujúca do porušenia fyziologickej rovnováhy v systéme T_H1/T_H2-lymfocytov (20, 56). Vznik tejto nerovnováhy sa snaží vysvetliť niekoľko hypotéz, medzi ktoré patrí aj hygienická hypotéza (56, 61). Vychádza zo skutočnosti, že v posledných desaťročiach sa vo vyspelých krajinách zvýšila hygiena životného prostredia vrátane hygieny potravín a epidemiologickými, či terapeutickými zásahmi sa obmedzil výskyt infekcií osobitne v detskom veku. To zapríčiňuje nedostatok stimulačných signálov poskytovaných po stáročia určitými (najmä probiotickými) mikroorganizmami a nevyhnutne potrebných pre normálny vývoj a dozrievanie imunitného systému dospelého človeka. Tento stav sa prejavuje posunom rovnováhy T_H1/T_H2 v prospech T_H2-fenotypu, ktorý sa spája s atopiou. Prispieva k tomu aj nevhodná zmena v zložení črevnej mikroflóry vyvolaná kontamináciou nevhodnými (napr. „nemocničnými“) druhmi mikróbov a podávaním antibiotík (19). Výsledkom je potom epidemicky sa rozširujúci výskyt atopickej astmy a iných alergických ochorení (56).

Kľučovú úlohu pri rozpoznávaní patogénnych znakov mikroorganizmov infikujúcich hostiteľa majú TLRs a preto sa tieto zúčastňujú nielen na aktivácii mechanizmov prirodzenej imunity za účelom obrany, ale aj na správnom dozrievaní neatopického T_H1- fenotypu u kojencov a detí. Jeho podstatou je navodenie periférnej tolerancie na potravinové a inhalačné alergény (20, 55, 62). Dá sa preto predpokladať, že TLRs môžu byť významnými účastníkmi patogenézy atopickej astmy a iných alergických zápalových chorôb, ale súčasne aj možnými terčami pre farmakologický zásah. Zatiaľ je v tomto smere najviac informácií o TLR4 a jeho prídatnej molekule CD14, ktorá má pre väzbu LPS funkciu koreceptora. Ukázalo sa, že polymorfizmus CD14 sa významne odráža v hladinách IgE (10) a polymorfizmus TLR4 ovplyvňuje reaktívnosť dýchacích ciest (9). Analýza polymorfizmu TLRs by preto v budúcnosti mohla odhaliť polymorfné formy spojené s rizikom atopie a atopických chorôb.

Na druhej strane TLRs by sa mohli dať využiť na moduláciu alergického zápalu. Príkladom takejto možnosti je TLR9, ktorý v baktériových DNA rozpoznáva motív CpG. Väzba CpG oligodeoxynukleotidov na TLR9 indukuje v monocytoch a dendritových bunkách tvorbu IL-12 a IL-18 a následne produkciu IFN-g T-bunkami (14, 63), čo favorizuje T_H1-odpoveď. Aplikácia konjugátu CpG so špecifickým alergénom je schopná u viacerých živočíšnych druhov vrátane človeka utlmiť nepriaznivú T_H2-odpoveď (14, 53). To naznačuje možnosť takejto imunomodulácie aj pri atopických chorobách ľudí (48). Okrem toho CpG oligodeoxynukleotidy prostredníctvom TLR9 stimulujú proliferáciu B-lymfocytov a sekréciu imunoglobulínov (60), dozrievanie dendritových buniek a ich zvýšenú antigénovo-prezentačnú funkciu (35). Nedávno sa ukázalo, že pri týchto aktivitách je pozitívna kooperácia medzi TLR9 a TLR7 (14). To by mohlo naznačovať, že aj iné imunomodulačné látky by mohli pôsobiť prostredníctvom týchto dvoch receptorov.

Biologické funkcie TLRs, prípadne ich koreceptorov a prídatných proteínov nie sú ešte dostatočne objasnené. Tie, ktoré sú doteraz známe, sa prehľadne uvádzajú v schránke 1. Vyplýva z nej, že TLRs okrem obrany pred patogénnymi mikroorganizmami a regulácie zápalových a iných imunitných odpovedí sa môžu zúčastňovať aj na regulácii naprogramovanej bunkovej smrti (apoptózy) a na patogenéze septického šoku, atopických a niektorých autoimunitných, kardiovaskulárnych, neurodegeneračných, reumatických a nádorových chorôb (12, 48, 49). Možná je napr. účasť TLR2/TLR6, TLR4 a TLR9 na patogenéze reumatoidnej artritídy a viacerých chorôb spojiva (48, 59). Expresia TLR1, TLR2, TLR4 a TLR9 bola výrazne zvýšená v aterosklerotických plakoch, čo by mohlo poukazovať na ich účasť na patogenéze aterosklerózy (18).

Skúmajú sa možnosti na elimináciu patologických následkov vyvolaných prostredníctvom TLRs. Existujú pri tom dve stratégie: 1. Príprava špecifických rozpustných TLRs, ktoré by bäzbou na mikróbne ligandy (PAMPs) eliminovali ich pôsobenie na hostiteľa. 2. Vývoj malých molekúl, ktoré by zabránili cytoplazmovým doménam TLRs aktivovať intracelulárne signálne dráhy. Takouto by mohla byť napr. látka, ktorá vy zabránila adaptorovej molekule MyD88 nadviazať sa na TIR doménu vnútrobunkovej časti receptorov a tým na začiatku zastaviť prenos signálu (44).

Nedávne zistenie, že TLRs majú aj endogénne ligandy (tab. 2) do určitej miery spochybnilo doteraz akceptovanú predstavu, že tieto receptory vznikli vo fylogenetickom vývoji len za účelom obrany proti infekčným agensom. Ich význam je pravdepodobne širší. Možno ich považovať za receptory biologického dohľadu (surveillance receptors), ktoré rozpoznávajú endogénne aj exogénne molekuly vznikajúce pri tkanivovom poškodení, infekcii alebo remodelovaní tkaniva (12, 33). U človeka a stavovcov tieto receptory predstavujú TLRs, u bezstavovcov sú to Toll-receptory a v rastlinách produkty R-génov. Podľa tejto teórie by TLRs boli schopné odpovedať nielen na PAMPs z invadujúcich mikróbov, ale aj na rôzne degradačné produkty pochádzajúce z extracelulárneho matrixu (medzibunkovej hmoty) a vlastných buniek. To na jednej strane poskytuje výhodu účinnejšej aktivácie imunitných odpovedí aj na sterilné poškodenie tkaniva, ale na druhej strane potenciálnu možnosť zapojenia sa TLRs do patogenézy prakticky všetkých chorôb s účasťou zápalových procesov. Poznanie exogénnych i endogénnych ligandov týchto receptorov a mechanizmov prenosu nimi sprostredkovaných signálov poskytne potrebný obraz o ich vlastnostiach a tým aj možnosti farmakologického zásahu pri mnohých chorobných jednotkách vrátane tých, ktorých podstatou je alergický zápal.

1. Aderem A, Ulevitch RJ. Toll-like receptors in the induction of the innate immune response. Nature 2000; 406: 782-787.

2. Akira S. The role of IL-18 in innate immunity. Curr Opin Immunol 2000; 12: 59-63.

3. Akira S. Mammalian Toll-like receptors. Curr Opin Immunol 2003; 15: 5-11.

4. Akira S, Hemmi H. Recognition of pathogen-associated molecular patterns by TLR family. Immunol Lett 2003; 85: 85-95.

5. Alexopoulou L, Holt AC, Medzhitov P, Flavell RA. Recognition of double-stranded RNA and activation of NF-kB by Toll-like receptor 3. Nature 2001; 413: 732-738.

6. Aliprantis AO, Yang RB, Mark MR, Suggett S, Devaux B, Radolf JD, Klimpel GR, Godowski P, Zychlinsky A. Cell activation and apoptosis by bacterial lipoproteins through Toll-like receptor – 2. Science 1999; 285: 736-739.

7. Aliprantis AO, Yang RB, Weiss DS, Godowski P, Zychlinsky A. The apoptotic signaling pathway activated by Toll-like receptor 2. EMBO J 2000; 19: 3325-3336.

8. Arbibe L, Mira JP, Teusch N, Kline L, Guha M, Mackman N, Godowski PJ, Ulevitch RJ, Knaus UG. Toll-like receptor 2-mediated NF-kB activation requires a Rac1-dependent pathway. Nat Immunol 2000; 1: 533-540.

9. Arbour NC, Lorenz E, Schutte BC. TLR4 mutations are associated with endotoxin hyporesponsiveness in humans. Nature Genet 2000; 25: 187-191.

10. Baldini M, Lohman IC, Halonen M, Erickson RP, Holt PG, Martinez FD. A polymorphism in the 5,flanking region of the CD14 gene is associated with circulating soluble CD14 levels and with total serum immunoglobulin E. Am J Respir Cell Molec Biol 1999; 20: 976-983.

11. Bauer S, Kirschning CJ, Hacker H, Redecke V, Hausmann S, Akira S, Wagner H, Lipford GB. Human TLR9 confers responsiveness to bacterial DNA via species specific CpG motif recognition. Proc Natl Acad Sci USA 2001; 98: 9237-9242.

12. Beg AA. Endogenous ligands of Toll-like receptors: implications for regulating inflammatory and immune responses. Trends Immunol 2002; 23: 509-512.

13. Beutler B. The Toll-like receptors as the primary sensors of the innate immune system. Immunologist 2000; 8: 123-130.

14. Bohle B. CpG motifs as possible adjuvants for the treatment of allergic diseases. Int Arch Allergy Immunol 2002; 129: 198-203.

15. Bowie A, O,Neil LAJ. The interleukin-1 receptor/Toll-like receptor superfamily: signal generators for pro-inflammatory interleukins and microbial products. J Leukoc Biol 2000; 67: 508-514.

16. Burns K, Clathworthy J, Martin L, Martinon F, Plumpton C, Maschera B, Lewis A, Ray K, Tschoopp J, Volpe F. Tollip a new component of the IL-1RI pathway, links IRAK to the IL-1 receptor. Nat Cell Biol 2000; 2: 346-451.

17. Daun JM, Fenton MJ. Interleukin-1/toll receptor family members: Receptor structure and signal transduction pathways. J Interferon Cytokine Res 2000; 20: 843-855.

18. Edfeldt K, Swedenborg J, Hansson GK, Yan CO. Expression of toll-like receptors in human atherosclerotic lesions – A possible pathway for plaque activation. Circulation 2002; 105: 1158-1161.

19. Ferenčík M, Ebringer L. Možnosti využitia probiotík v prevencii a terapii alergických chorôb. Alergie 2002; 4: 48-54.

20. Ferenčík M, Pružinec P. Je alergická astma len imunologická choroba? Klin Imunol Alergol 2002; 12, č. 3: 5-9.

21. Fitzgerald KA, Palsson-McDermot EM, Bowie AG, Jefferies CA, Mansell AJ, Brady B, Brint B, Dunne A, Gray P, Harte MT. Mal (MyD88-adapter-like) is required for Toll-like receptor – 4 signal transduction. Nature 2001; 413: 78-83.

22. Greenberg S, Grinstein S. Phagocytosis and innate immunity. Curr Opin Immunol 2002; 14: 136-145.

23. Habich C, Baumgart K, Kolb H, Burkart V.: The receptor for heat shock protein 60 on macrophages is saturable, specific, and distinct from receptors for other heat shock proteins. J Immunol 2002; 168: 569-576.

24. Hallman M, Ramet M, Ezekowitz RA. Toll-like receptors as sensors of pathogens. Pediat Res 2001; 50: 315-321.

25. Hayashi F, Smith KD, Ozinsky A, Hoewn TR, Yi EC, Goodlett DR, Eng JK, Akira S, Underhill DM, Aderem A. The innate immune response to bacterial flagellin is mediated by Toll-like receptor 5. Nature 2001; 410: 1099-1103.

26. Hemmi H, Takeuchi O, Kawai T, Kaisho T, Sato S, Sonjo H, Matsumoto M, Hoshimo K, Wagner H, Takeda K, Akira S. A Toll-like receptor that recognizes bacterial DNA. Nature 2000; 408: 740-745.

27. Henderson B, Poole S, Wilson M. Bacterial modulins: a novel class of virulence factors which cause host tissue pathology by inducing cytokine synthesis. Microb Rev 1996; 60: 316-341.

28. Hirschfeld M, Ma Y, Weis JH, Vogel SN, Weis JJ. Cutting edge: repurification of lipopolysaccharide eliminates signaling through both human and murine toll-like receptor 2. J Immunol 2000; 165: 618-622.

29. Horng T, Barton GM, Medzhitov R. TIRAP an adapter molecule in the Toll signaling pathway. Nat Immunol 2001; 2: 835-841.

30. Ito T, Amakawa R, Fukuhara S. Roles of Toll-like receptors in natural interferon-producing cells as sensors oh immune surveillance. Human Immunol 2002; 63: 1120-1125.

31. Janeway CA Jr. Approaching the asymptote? Evolution and resolution in immunology. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 1989; 54: 1-13.

32. Janeway CA Jr, Medzhitov R. Introduction: the role of innate immunity in the adaptive immune response. Semin Immunol 1998; 10: 349-350.

33. Johnson GB, Brunn GJ, Tang AH, Platt JL. Evolutionary clues to the functions of Toll-like family as surveillance receptors. Trends Immunol 2003; 24: 19-24.

34. Jones BW, Heldwein KA, Means TK, Saukkonen JJ, Fenton MJ. Differential roles of Toll-like receptors in the elicitation of proinflammatory responses by macrophages. Ann Rheum Dis 2001; 60, Suppl III: 6-12.

35. Kadowaki N, Ho S, Antonenko S, Malefyt RD, Kastelein RA, Bazan F, Liu YJ. Subsets of human dendritic cell precursors express different toll-like receptors and respond to different microbial antigens. J Exptl Med 2001; 194: 863-869.

36. Krásna E, Stříž I. Interleukin 18 (IL-18) – prozánětlivý cytokin modulující Th1 i Th2 odpověď. Alergie 2002; 4: 307-315.

37. Krutzik SR, Sieling PA, Modlin RL. The role of Toll-like receptors in host defense against microbial infection. Curr Opin Immunol 2001; 13: 104-108.

38. Lien E, Sellati TJ, Yoshimura A. Toll-like receptor 2 functions as a pattern recognition receptor for diverse bacterial products. J Biol Chem 1999; 274: 33419-33425.

39. Lemaitre B, Nicholas E, Michaut L, Reichart JM, Hoffmann JA. The dorso-ventral regulatory gene cassette spatzle/Toll/Cactus controls the potent antifungal response in Drosophila adults. Cell 1996; 86: 973-983.

40. Means TK, Golenbock DT, Fenton MJ. Structure and function of Toll-like receptor proteins. Life Sci 2000; 68: 241-258.

41. Medzhitov R, Preston-Hurlburt P, Janeway CA. A human homologue to the Drosophila Toll protein signals activation of adaptive immunity. Nature 1997; 388: 394-397.

42. Muzio M, Polentarutti N, Bosisio D, Prahladan MKP, Mantovani A. Toll-like receptors: a growing family of immune receptors that are differentially expressed and regulated by different leukocytes. J Leukoc Biol 2000; 67: 450-456.

43. Ohashi K, Burkart V, Flohe S, Kolb H. Heat shock protein 60 is a putative endogenous ligand of the Toll-like receptor-4 complex. J Immunol 2000; 164: 558-561.

44. O,Neil LAJ, Dinarello CA. The IL-1 receptor/toll-like receptor superfamily: crucial receptors for inflammation and host defense. Immunol Today 2000; 21: 206-209.

45. Ozinsky A, Underhill DM, Fontenot JD, Hajjar AM, Smith KD, Wilson CB, Schroeder L, Aderem A. The repertoire for pattern recognition of pathogens by the innate immune system is defined by cooperation between toll-like receptors. Proc Natl Acad Sci USA 2000; 97: 13766-13771.

46. Re F, Strominger JL, Toll-like receptor 2 (TLR2) and TLR4 differentially activate human dendritic cells. J Biol Chem 2001; 276: 37692-37699.

47. Rock FL, Hardiman G, Timans JC, Kastelein RA, Bazan JF. A family of human receptors structurally related to Drosophila Toll. Proc Natl Acad Sci USA 1998; 95: 588-593.

48. Sabroe I, Parker LC, Wilson AG, Whyte MKB, Dower SK. Toll-like receptors: their role in allergy and non-allergic inflammatory disease. Clin Exp Allergy 2002; 32: 984-989.

49. Schuster JM, Nelson PS. Toll receptors: an expanding role in our understanding of human diseases. J Leukoc Biol 2000; 67: 767-773.

50. Sieling PA, Modlin RL. Toll-like receptors: mammalian „taste receptors“ for a smorgasbord of microbial invaders. Curr Opin Microbiol 2002; 5: 70-75.

51. Sims JE. IL-1 and IL-18 receptors, and their extended family. Curr Opin Immunol 2002; 14: 117-122.

52. Smiley ST, King JA, Hancock WW. Fibrinogen stimulates macrophage chemokine secretion through Toll-like receptor 4. J Immunol 2001; 167: 2887-2894.

53. Takeda K, Akira S. Regulation of innate immune responses by toll-like receptors. Jap J Infect Dis 2001; 54: 209-219.

54. Tighe H, Takabayashi K, nSchwartz D. Conjugation of immunostimulatory DNA to the short ragweed allergen amb a1 enhances its immunogenicity and reduces allergenicity. J Allergy Clin Immunol 2000; 106: 124-134.

55. Tsitoura DC, Blumenthal RL, Berry G, DeKruyff RH, Umetsu DT. Mechanisms preventing allergen-induced airways hyperreactivity. Role of immune deviation and tolerance. J Allergy Clin Immunol 2000; 106: 239-246.

56. Umetsu DT, McIntire JJ, Akbari D, Macaubas C, DeKruyff RH. Asthma: an epidemic of dysregulated immunity. Nature Immunol 2002; 3: 715-720.

57. Underhill DM, Ozinsky A. Toll-like receptors: key mediators of microbe detection. Curr Opin Immunol 2002; 14: 103-110.

58. Underhill DM, Ozinsky A, Hajjar AM, Stevens A, Wilson CB, Bassetti M, Aderem A. The Toll-like receptor 2 is recruited to macrophage phagosomes and discriminates between pathogens. Nature 1999; 401: 811-815.

59. van der Heijden IM, Wilbrink B, Tchetverikov I. Presence of bacterial DNA and bacterial peptidoglycans in joints of patients with rheumatoid arthritis and other arthritides. Arthritis Rheumatism 2000; 43: 593-598.

60. Verthelyi D, Ishii KJ, Gursel M, Takeshita F, Klinman DM. Human peripheral blood cells differentially recognize and respond to two distinct CpG motifs. J Immunol 2001; 166: 2372-2377.

61. von Mutius E. The environmental predictors of allergic disease. J Allergy Clin Immunol 2000; 105: 9-19.

62. Weiner HL. The mucosal milieu creates tolerogenic dendritic cells and Tr1 and Tr3 regulatory cells. Nature Immunol 2001; 2: 671-672.

63. Wild JS, Sur C. CpG nucleotide modulation of allergic inflammation. Allergy 2001; 56: 365-376.