LABORATORNÍ DIAGNOSTIKA A SLEDOVÁNÍ STAVU DIABETES MELLITUS

1. Souhrn základních poznatků

- Glukóza v plazmě na lačno – FPG

- HbA1c

- OGTT

- Albumin v moči

- Glukóza v krvi měřením glukometry

Role: Nástroj laboratorní diagnózy diabetes mellitus.

Kritéria WHO/ADA

Vyloučení diabetes mellitus < 6,1 mmol/l

Zvýšené riziko diabetu (IFG) 6,1 mmol/l

až < 7,0 mmol/l

Diabetes 7,0 mmol/l

(potvrdit opakovaným

měřením)

Role: Nástroj sledování stavu diabetu.

Kritéria WHO/ADA

Cílová hodnota < 7,0 8,0

(viz též kapitola 11 – Doporučení ČSKB a ČDS o změně kalibrace hemoglobinu A1c a referenčních mezí)

Role: Diagnóza diabetu

Vyloučení diabetes mellitus < 7,8 mmol/l

Porušená glukózová tolerance 7,8 mmol/l

až < 11,1 mmol/l

Diabetes 11,1 mmol/l

Role: Klasifikace stavu mikroalbuminurie jako průkazu časné detekce diabetické nefropatie. Diagnostický závěr je nutno učinit na podkladě tří opakovaných měření.

Role: Sledování stavu diabetika v režimu POCT nebo jeho sebesledování

Kritéria: Hodnoty rozhodovacích limitů a četnost měření nejsou striktně definovány

Přesnost (reprodukovatelnost) CV < 2,5 [%]

Pravdivost (bias) b < 2,0 [%]

Návaznost na referenční metodu ID-GC/MS

Analytická nejistota Uc cca 5,0 [%]

Poznámka: Analytická nejistota je statistické vyhodnocení kombinace přesnosti a pravdivosti měření.

Přesnost (reprodukovatelnost) CV 3-4 [%]

Pravdivost (bias) b 4,0 [%]

Návaznost na referenční

metodu DCCT respektive IFCC

Přesnost (reprodukovatelnost) CV < 15 [%]

Návaznost hodnot pracovních

kalibrátorů na CRM 470

Celková chyba měření (diference od laboratorní

metody měření FPG)

pro koncentrace > 3,3 - 5,5 mmol/l 10 - 20 [%]

pro koncentrace < 3,3 - 5,5 mmol/l 0,5 - 0,8 [mmol/l]

Materiál: žilní krev

Odběr: Po minimálně 8hodinovém lačnění

S vyloučením fyzické námahy

S vyloučením kouření

Vsedě

Do odběrové nádobky

s antiglykolytickou směsí

(2,5ch

uzávěrů)

od krevních elementů: Do 60 minut od odběru

Transport do laboratoře: Okamžitý

Přepočetní faktory: FPG = 1,11 x B- glukóza (je-li

vzorek krve ředěn před

analýzou)

FPG = 0,94 x B-glukóza

(je-li vzorek krve měřen bez ředění) (Hodnoty obou faktorů představují statistický průměr a mají významnou intraindividuální variaci)

Materiál: žilní nebo kapilární krev

Odběr: do EDTA

Skladování: nejméně 1 týden při 4 °C

nejméně 1 rok při -80 °C

Materiál: Sběr moči za 24 hodin

Časovaný sběr (za 4 hodiny nebo přes noc)

Náhodný vzorek (druhá ranní moč)

Sběr, odběr: S úplným vyloučením fyzické námahy

Skladování: 1 týden při 4 °C

6 měsíců při -70 °C

- Platný certifikát úspěšnosti v oficiálním programu externího hodnocení kvality

- Akreditace klinické laboratoře (v blízké budoucnosti)

 

- Platný certifikát úspěšnosti v oficiálním programu externího hodnocení kvality

 

- Platný certifikát úspěšnosti v oficiálním programu externího hodnocení kvality

 

- Zavedený a fungující systém vnitřní kontroly kvality

- Splnění kritéria celkové chyby měření jako diference od laboratorní metody měření glukózy v plazmě

- Systém zácviku a jeho prověřování u osob používajících glukometry

 

 

2. Stanovení glukózy jako nástroj určení diagnózy diabetes mellitus

Koncentrace FPG je nástrojem:

- určení diagnózy diabetes mellitus

- vyhledávání osob se zvýšeným rizikem diabetes mellitus

 

- Kombinace klinických symptomů s náhodným stanovením koncentrací glukózy v plazmě 11,1 mmol/l

- Koncentrace glukózy v plazmě nalačno (FPG) 7,0 mmol/l

- Koncentrace glukózy v plazmě po 2 hodinách po zátěži při orálním glukózovém tolerančním testu OGTT 11,1 mmol/l

 

Diagnostický limit pro FPG byl určen ROC analýzou při aplikaci OGTT jako „zlatého diagnostického standardu, kdy byla získána hodnota 6,8 mmol/l, nebo dosažením shody prevalence FPG s OGTT, kdy byly v různých studiích získány hodnoty 6,7-7,0 mmol/l (4).

K učinění závěru o diagnóze diabetu je nezbytné potvrdit výsledek opakovaným měřením z dalšího odběru v některém z příštích dnů.

Poznámka: OGTT je sice v doporučení WHO uveden, avšak není doporučován s patřičným důrazem. Doporučení ADA (Americké diabetologické asociace) považuje OGTT za diagnostický nástroj pouze v případě gestačního diabetes mellitus. Podrobněji se problematika rozebírá v části 8.

Zvýšené riziko diabetu je charakterizováno rozhodovacím limitem pro FPG 6,1 mmol/l, tj. intervalem hodnot 6,1 - 6,99 mmol/l. Pro tento stav označovaný ADA jako Impaired Fasting Glucose (IFG) je navržen český termín Hraniční glukóza nalačno (HGL).

V doporučení WHO (5) je odhadována prevalence diabetu u populace, „žijící západním stylem“ 6 - 7,6 % diabetiků není vůbec diagnostikováno. Materiály ADA (4) udávají hodnoty prevalence diabetes mellitu v populaci USA v závislosti na hodnotě diagnostického rozhodovacího limitu následovně:

Bez limitu 7,26

7,8 (dřívější WHO limit) 14,26

7,0 (současný limit WHO přijatý v ČR) 12,27

Prevalence diabetes mellitus v České republice není přesně známa, ale odhady se podstatně neliší od výše uvedených.

Krev se odebírá po hladovění (lačnění) přes noc, minimálně však po dobu 8 hodin. Jakákoliv fyzická námaha musí být vyloučena, stejně jako kouření. Pacient má být při odběru v klidové poloze (v sedě). Vzorek žilní krve se odebírá do odběrové nádobky s obsahem inhibitoru glykolýzy. Obvyklou kombinací pro zisk plazmy s dostatečnou stabilitou glukózy je směs fluoridu sodného a EDTA. K účinné inhibici glykolýzy je nutná koncentrace minimálně 2,5Někteří autoři doporučují umístit zkumavky s krví před oddělením plazmy do ledové vodní tříště.

FPG = B-glukóza x 1,11

jestliže je vzorek krve před analýzou ředěn hemolyzačním nebo deproteinačním činidlem,

FPG = B-glukóza x 0,94

jestliže je vzorek krve měřen bez ředění.

Z dostupných dat nelze jednoznačně určit, zda mezi hodnotami koncentrací glukózy v séru a plazmě jsou významné systematické rozdíly. Naprostá většina literárních dat však považuje obě hodnoty za rovnocenné. Také četné publikované hodnoty referenčních intervalů téměř nikdy nerozlišují mezi plazmou a sérem. Nicméně doporučení WHO a ADA jednoznačně preferují plazmu před krevním sérem.

Rozdíl mezi žilní a kapilární krví je dále uveden v části 8.

Požadovaná přesnost je definována vztahem

Požadovaná hodnota pravdivosti (vyjádřené jako bias) je definována vztahem

CV_a [%] je analytická reprodukovatelnost měření, vyjádřená jako variační koeficient;

CV_i [%] je hodnota intraindividuální biologické variace FPG, vyjádřená jako variační koeficient, její hodnota je 4,9CV_b [%] je hodnota celkové biologické variace FPG, vyjádřená jako variační koeficient, vypočtené kovariancí intraindividuální a skupinové (populační) biologické variace, její hodnoty jsou uváděny v literatuře v intervalu 7-10 %;

b [%] je hodnota bias měření definovaná jako odchylka průměru vhodného počtu opakovaných výsledků měření od referenční hodnoty (získané referenční metodou).

(K vyhodnocení hodnoty bias lze doporučit provedení duplicitních měření kontrolních materiálů s hodnotou glukózy, získanou referenční metodou po dobu pěti dnů.)

Hodnoty přesnosti a pravdivosti požadované pro měření FPG jsou pak tyto:

Při dosažení těchto hodnot reprodukovatelnosti a bias je dosaženo vysoké pravděpodobnosti, že četnost falešných diagnostických klasifikací nepřekročí hodnotu 5ě nezávislá měření u jednoho pacienta.

Klinické laboratoře používající měření FPG k diagnóze diabetu a jeho zvýšeného rizika musí vlastnit certifikát úspěšnosti v programech externího hodnocení kvality. Platnost certifikátu je maximálně 6 měsíců. Americké laboratorní doporučení diagnózy diabetes mellitus (3) vyžaduje též akreditaci příslušné klinické laboratoře.

Dílčími nejistotami, které musí být v každém případě vzaty do úvahy při hodnocení výsledku měření, jsou:

- nejistota preanalytických procesů (odběr, skladování, transport do laboratoře),

- reprodukovatelnost analytických měření,

- bias analytických měření,

- intraindividuální biologická variace.

I při dosažení požadovaných analytických ukazatelů (viz výše) a při předpokladu natolik optimalizovaného preanalytického procesu, že jeho variabilita nepřesahuje hodnotu 1 %, nelze předpokládat, že kombinovaná nejistota individuálního výsledku měření, vypočtená pro 95 % interval spolehlivosti, poklesne při započtení dílčích nejistot preanalytického, analytického a biologického původu pod 12 %. Protože nejvyšší podíl (> 50 %) hodnoty kombinované nejistoty musíme přičíst intraindividuální biologické variaci, plynou z toho přinejmenším tři důležité důsledky:

• Kromě výjimečných, jasně specifikovaných situací nelze provést diagnostický závěr na bázi jediného výsledku měření.

• Při vyhledávání osob se zvýšeným rizikem DM je nutno uvážit, že již hodnota FPG = 5,4 mmol/l signalizuje potřebu častějšího provedení stanovení FPG.

• Hodnoty FPG vyšší než 6,1 mmol/l by měly být vždy opakovány jako podezřelé z možného potvrzení diagnózy diabetes mellitus.

Klinické laboratoře by měly být v souladu s požadavky akreditačních norem (např. ISO 15189:2003) schopné doložit na požádání svou nejistotu měření FPG (10).

Referenční metody měření FPG jsou založeny na principu ID-GC/MS (izotopová diluce - plynová chromatografie / hmotnostní spektrometrie). Referenční metody musí být použity ke stanovení hodnot glukózy v referenčních materiálech a v materiálech externího hodnocení kvality (měly by být též používány v laboratorních programech vnitřní kontroly kvality).

- mají hodnoty koncentrace glukózy stanovené referenční metodou - disponují certifikovanými hodnotami koncentrace glukózy,

- mají být testovány na nekomutabilitu (má být prokázáno, že vlivy matrice jsou minimalizovány - zanedbatelné),

- mají určenou nejistotu.

 

Klinické laboratoře musí používat kalibrátorů, jejichž výrobci jsou schopni dokumentovat (v souladu s normou IVD MD), že hodnoty koncentrace glukózy v nich jsou určeny srovnáním s referenčními materiály. To značí, že kalibrátory rutinních metod musí mít dokumentovanou návaznost na referenční metodu ID-GC/MS. Výrobci musí uvádět rovněž vlastní nejistoty kalibračních hodnot.

Požaduje se

- aby byly jejich hodnoty koncentrace glukózy získány referenční metodou a certifikovány,

- aby byly tyto hodnoty dostupné i se svou rozšířenou nejistotou (faktor překrytí k = 2),

- aby byly minimalizovány vlivy osnovy - matrice.

 

 

3. Glykovaný hemoglobin HbA_1c - nástroj sledování průběhu léčby diabetes mellitus

Podíl látkové koncentrace HbA_1c na celkovém hemoglobinu krve je považován za rutinní a nejvíce efektivní nástroj sledování průběhu DM. Představuje nejlepší způsob kontroly koncentrací glukózy u diabetiků, neboť je považována za její vážený dlouhodobý průměr.

Kritéria kompenzace používaná v ČR (viz kapitola 11)

Pouze kritéria pro kompenzované diabetiky a kritéria pro diabetiky vyžadující změnu terapie jsou oficiálními kritérii sledování průběhu diabetu. Kritérium, diskriminující nediabetiky od diabetiků není doposud doporučeno k používání pro diagnostickou klasifikaci.

 3.3. Preanalytické podmínky

Plná krev odebraná ze žíly nebo kapilární krev odebraná po vpichu z prstu jsou rovnocenné materiály. Odběrové nádobky obsahují antikoagulační činidlo, obvykle se používá EDTA.

Stabilita HbA_1c:

- 1 týden při 4 °C

- minimálně 1 rok při -70 °C a nižší teplotě

 

Pro skladování při -20 °C se uvádějí kontroverzní literární údaje o stabilitě, a nemůže být proto doporučeno.

Vlivy věku, pohlaví, etnicity, ročního období nejsou považovány za významné.

Hemoglobinopatie ovlivňují výsledky měření, ale nesystematicky a v závislosti na metodě měření. V případě neočekávaného výsledku je však třeba pomyslet i na ně. Záznamy chromatogramů (HPLC, LC) dávají dobrou možnost zpětné kontroly jejich výskytu.

Anémie může být příčinou snížených výsledků měření.

U uremických pacientů dochází ke karbamylaci hemoglobinu, která působí silné interference při měření HbA1c v závislosti na použité metodě.

Všechna uvedená kritéria jsou platná pouze za předpokladu, že použité metody měření, měřicí přístroje a pracovní kalibrátory mají certifikovanou návaznost na referenční systém NGSP USA (National Glycohemoglobin Standardization Program).

Referenční metodou programu NGSP USA je metoda vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC), označovaná jako referenční metoda DCCT (Diabetes Control and Complications Trial).

Referenční materiály mají hodnotu HbA_1c stanovenu o referenční metodou DCCT.

Návaznost rutinní metody na referenční metodu DCCT vyžaduje dosažení reprodukovatelnosti CV 3,0 [%] a systematické odchylky od referenční metody 1 % (vyhodnocení diferenčním diagramem dle Blanda - Altmana).

Kontrolní materiály programů externího hodnocení kvality musí mít cílové hodnoty určené referenční metodou DCCT.

Uvedená kritéria jsou předpokladem pro akreditaci laboratoře.

- Reprodukovatelnost CV 3,0 [%] (ideální hodnota);

- CV 4 [%] (ještě akceptovatelná hodnota);

- Dokument o certifikaci návaznosti použitých měřících systémů HbA_1c;

- Úspěšná účast ve dvou cyklech programů mezilaboratorního porovnávání (EHK) za jeden rok.

 

 

Hodnota intraindividuální biologické variability je podle údajů NGSP (USA) velmi nízká: CV_i = cca 1 %.

Vysoká stabilita analytu dovoluje zanedbat nejistotu způsobenou preanalytickým rozptylem.

Po kombinaci dílčích nejistot korespondujících s reprodukovatelností, hodnotou bias a hodnotou CV_i [%] lze odhadnout výslednou kombinovanou nejistotu (odpovídající 95% intervalu spolehlivosti) na 7 %. Vyjádříme-li hodnoty rozhodovacích kritérií s použitím nejistoty, pak platí:

7,0 ± 0,4 [HbA1c %]

8,0 ± 0,5 [HbA1c %]

Jiní autoři v dobře dokumentované studii (28) však uvádějí hodnotu CVi = 4,1 %. V tomto případě lze odhadnout hodnotu kombinované nejistoty na 11 %, a proto obdržíme širší intervaly hodnot rozhodovacích kritérií:

7 ± 0,77 [HbA1c %]

Metoda IFCC je na konci několikaletého vývoje. Je založena na principu HPLC/MS (vysokoúčinná kapalinová chromatografie v kombinaci s hmotnostní spektrometrií) nebo alternativně HPLC/CE (vysokoúčinná kapalinová chromatografie v kombinaci s kapilární elektroforézou).

Metoda IFCC poskytuje významně nižší výsledky měření než metoda DCCT.

Prozatímní odhad nových rozhodovacích kriterií, založených na použití nové referenční metody IFCC (viz kapitola 11):

Osoby bez přítomnosti DM 4,0 %

Kompenzovaní diabetici 5,5 %

Potřeba změny terapie 6,5 %

V současné době se do rutinní vyšetřovací palety diabetiků nezařazuje.

Ketoaminy sérových proteinů (zejména pak albuminu) redukují v slabě alkalickém prostředí (pH 10,35) nitrotetrazoliovou modř (NTB) na formazany, jejichž množství se měří fotometricky. Měření je standardizováno pomocí poly-l-lysinu nebo pomocí glykovaného proteinu, přičemž stupeň glykace je v kalibrátorech stanoven organickou elementární analýzou. Hodnota 285 čního intervalu. Při stanovení interferuje kyselina askorbová, kyselina močová, bilirubin a methyldopa (5). Snížená proteosyntéza v játrech a zvýšená renální clearence proteinů při zánětlivých chorobách působí sníženou koncentraci fruktózaminu v séru. Poločas fruktózaminu je pouze 10 - 14 dní, zatímco u HbA1c je jeho hodnota asi 120 dní. Stanovení fruktózaminu lze doporučit jen v případech, kdy není možné spolehlivé měření HbA1c (hemoglobinpatie, anemie), ale nelze je považovat za rovnocennou náhradu stanovení HbA1c (4). V případě použití je nutno opakovat měření 1x měsíčně (zatímco měření HbA1c se doporučuje provádět 3-4x ročně).

4. Sledování stavu diabetiků měřením glukózy osobními glukometry (15,16,17)

Koncentrace glukózy v kapilární krvi, stanovená pomocí osobního glukometru je nástrojem sledování stavu všech diabetiků závislých na insulinu (diabetes 1. typu) a některých vybraných skupin diabetiků 2. typu. Toto sledování nehraje žádnou roli v diagnostice diabetu a nemá s ní ani žádnou spojitost.

Vyžaduje se důkladná instrukce a zácvik zdravotnického personálu na klinických odděleních a pacientů před zahájením sledování. Nedílnou součástí instrukcí jsou postupy kontroly kvality.

Významné potenciální zdroje preanalytických chyb jsou:

- Změny hodnot hematokritu

- Změny teploty a vlhkosti vnějšího prostředí

- Vysoké koncentrace triacylglycerolů v krevním séru

- Hypoxie a hypotense pacienta

- Použití vzorku krve s obsahem glykolytického inhibitoru

 

Na trhu jsou k dispozici desítky různých typů glukometrů produkované a dodávané řadou výrobců. Úroveň shody mezi výsledky dosaženými různými typy glukometrů je však doposud nízká. Teprve v současné době se intenzivně pracuje na jejím zlepšení dosažením porovnatelnosti s referenční metodou prostřednictvím referenčních materiálů s certifikovanými hodnotami glukózy.

- Používání nových typů instrumentace s vyloučením nutnosti odstraňovat přebytek krve, s akustickou kontrolou objemu vzorku, s automatickým časováním doby reakce, se čtečkou čárového kódu, s možností ukládat data výsledků vzorků a kontrolních analýz do paměti glukometru;

- Preferování glukometrů kalibrovaných tak, aby získané výsledky měření v krvi odpovídaly hodnotám glukózy v plazmě;

- Preferování glukometrů s návazností kalibrační funkce a vlastního měření na certifikované referenční materiály, v nichž byla koncentrace glukózy stanovena referenční metodou.

 

 

Je navrženo několik možných postupů realizace kontroly kvality. Obecně přístupným postupem je porovnávání výsledků, dosažených glukometry s výsledky laboratorní metody měření FPG. Ukazatelem kvality je velikost diference mezi oběma výsledky (celková chyba měření). Navržené hodnoty akceptovatelné celkové chyby měření se však od sebe značně liší. Tento fakt lze demonstrovat na rozdílnosti údajů, pocházejících z různých zdrojů.

Obecně lze pozorovat, že kritérium pro celkovou chybu 5–10ěřících zařízení splnit.

Reprodukovatelnost měření by měla dosahovat hodnot CV 3,0ózy korespondující s hypoglykemickými stavy (údaje jsou založeny na studiích, v nichž svůj stav pozorovali a hodnotili samotní pacienti).

Kontrolní materiál je představován souborem pěti vzorků žilní krve s hematokritem 0,35–0,50 o teplotě 18–28 °C s následujícími koncentracemi:

1 1,7–2,8

2 2,9–6,1

3 6,2–8,3

4 8,4–13,9

5 14,0–22,2

- Testuje se minimálně 10 balení výrobní šarže a minimálně 10 glukometrů systému.

- Pro každou testovanou jednotku je nutné vykonat deset opakovaných měření výše uvedených vzorků.

- Vypočte se průměr měření, hodnota kumulativní směrodatné odchylky a variačního koeficientu. Koncentrace pod 4,2 mmol/l se hodnotí pomocí směrodatné odchylky, koncentrace nad 4,2 mmol/l pomocí variačního koeficientu.

 

Požadované hodnoty opakovatelnosti nebyly dosud zveřejněny.

Jako kontrolní materiál slouží materiál dodávaný výrobcem. Používá se tří vzorků s následujícími intervaly koncentrací:

1 1,7–2,8

2 5,3–8,0

3 15,5–23,3

- Testuje se deset balení výrobní šarže a deset glukometrů.

- Každý vzorek se měří jednou denně po dobu deseti dnů.

 

Reprodukovatelnost se hodnotí jako hodnota směrodatné odchylky pro koncentrace nižší než 4,2 mmol/l a jako hodnota variačního koeficientu pro koncentrace nad 4,2 mmol/l. Rovněž požadované hodnoty reprodukovatelnosti nebyly dosud obecně přijaty.

Používá se vzorků kapilární krve o teplotě 18–28 °C, pocházejících od nejméně 100 různých jedinců a vykazujících následující diverzifikaci koncentrací:

5 < 2,8

15 2,8–4,3

20 4,4–6,7

30 6,7–11,1

15 11,2–16,6

10 16,6–22,2

5 > 22,2

Testuje se minimálně 10 balení výrobní šarže. Každý vzorek se měří referenční metodou v duplikátu a na dvou glukometrech výrobce. Vyhodnocení se provádí diferenčním diagramem, kde na ose x jsou referenční hodnoty dosažené laboratorní metodou měření FPG a na ose y diference měření glukometry od referenčních hodnot, uvedené v mmol/l. Při aplikaci regresní analýzy se obdobně používá osy x pro výsledky referenční metody a osy y pro výsledky dosažené na glukometrech.

95 % výsledků, dosažených na glukometrech musí vykazovat následující maximální diference od referenční metody:

• ± 0,83 mmol/l pro koncentrace nižší než 4,2 mmol/l

• ± 20 % pro koncentrace vyšší než 4,2 mmol/l

 

Tyto požadavky mohou sloužit jako základní orientace při výběru osobních glukometrů v souladu s doporučeními POCT vypracovanými výborem České společnosti klinické biochemie (www.cskb.cz).

Laboratorní měření by mělo být omezeno na měření FPG pro diagnostické účely a na měření plazmatické glukózy jako referenční metody sledování kvality měření glukometrů.

Pro měření glukózy v krvi glukometry by měly být vyvinuty a rutinně používány pravidelné programy externího hodnocení kvality.

5. Albumin v moči jako nástroj časné detekce diabetické nefropatie

Měření koncentrace albuminu v moči diabetiků je doporučeno pro jeho významnou schopnost časné predikce diabetické nefropatie. Zvýšené vylučování albuminu močí, které předpovídá stav nefropatie, ale které není detekovatelné kvalitativními metodami realizovanými běžnými testovacími proužky pro průkaz proteinů v moči, či jinými metodami kvalitativní analýzy, se označuje jako mikroalbuminurie.

Sběr moči 30 - 299ý vzorek 20 - 199

Hodnoty uvedených kritérií byly verifikovány a potvrzeny řadou studií. Klinická citlivost, zjištěná na bázi velké meta analytické studie (21) dosáhla hodnoty 91 %.

Mikroalbuminurii lze požadovat za prokázanou, jestliže je překročení uvedených kritérií dosaženo ve dvou ze tří po sobě následujících vzorcích moči analyzovaných v intervalu 3–6 měsíců (19). Potřeba zvýšeného počtu měření je dána vysokou hodnotou intraindividuální biologické variace albuminu v moči. Hodnoty přesahující uvedené horní intervaly uvedených kritérií jsou označovány jako proteinurie. Ty lze již spolehlivě detekovat kvalitativními zkouškami na celkové proteiny prováděnými testovacími proužky, naopak analýza vzorků s proteinurií je zcela nevhodná k stanovení mikroalbuminurie imunochemickými metodami (nebezpečí „hook efektu“).

Národní doporučení dává přednost 2. rannímu vzorku moče nebo stanovení ve sběru moče získaném během nočního odpočinku. Vyšetření v moči sbírané 24 hodin se v ČR nedoporučuje.

Mezinárodní doporučení pro detekci mikroalbuminurie preferují stanovení albuminu ve sběru moči za 24 hodin před stanoveními v jednorázových vzorcích moči s hodnotami albuminu vztaženými ke koncentraci kreatininu v moči nebo v časových vzorcích vyjádřených jako ů jsou akceptovány. Při aplikaci jednorázových vzorků jde vždy o vzorky první ranní moče (20), u časovaných vzorků se jedná o sběr za 4 hodiny nebo o vzorek sebraný přes noc.

Albumin je v moči stabilní minimálně 1 týden při teplotě 4–20 °C. Zatímco během skladování při -20 °C lze pozorovat mírné snižování koncentrace albuminu v moči, při teplotě -70 °C a nižší k poklesu koncentrace nedochází ani po 6 měsících uskladnění.

U diabetiků nevykazuje albumin v moči diurnální variabilitu.

Koncentrace albuminu v moči jsou ovlivňovány akutními chorobnými stavy, infekcí močových cest, zvýšenou fyzickou námahou, zvýšenou koncentrací glukózy v krvi, infekcí GIT, kardiálními chorobami, arteriální hypertenzí.

Imunoturbidimetrie a imunonefelometrie jsou považovány za vhodné rutinní metody měření.

Požadovaná reprodukovatelnost měření je CV < 15 %.

Akceptovatelné hodnoty bias musí být zabezpečeny realizací návaznosti rutinní metody na mezinárodní referenční materiál CRM 470, tedy odvozením hodnoty pracovního kalibrátoru porovnáním s materiálem CRM 470.

Mez detekce musí dosahovat minimálně hodnoty 20 ho proteinu v moči diagnostickým proužkem se stanovení mikroalbuminurie neprovádí (je překročen pracovní rozsah měření).

Dosavadní údaje ukazují velmi nízké hodnoty klinické citlivosti těchto zkoušek. Ty se navíc snižují, jestliže jsou zkoušky prováděny na nemocničních odděleních nebo v ordinacích praktických lékařů. V současné době lze učinit relevantní závěry o přítomnosti/nepřítomnosti mikroalbuminurie pouze na bázi kvantitativních laboratorních metod. Kvalitativní detekce mikroalbuminurie může hrát roli pouze jako nástroj screeningu, avšak každý pozitivní nález musí být potvrzen kvantitativním měřením.

6. Koncentrace glukózy v moči

Kvalitativní ani kvantitativní zkoušky průkazu či měření glukózy v moči nejsou řazeny mezi základní nástroje diagnózy diabetu ani  sledování jeho stavu (1, 2, 3, 4, 5).

Znalost hodnot glukózy v moči nepřináší žádné zásadní informace o stavu pacienta, jeho choroby a nemá kauzální vztah k hodnotě glukózy v plazmě (krvi), pokud její hodnota nepřekročí 10 mmol/l (renální práh). Interindividuální hodnota renálního prahu však silně kolísá.

Sledování glukózy v moči může sloužit pouze jako nedokonalá náhrada sledování glukózy v krvi osobními glukometry, a to jen tam, kde není pacient prokazatelně schopen/ochoten dosáhnout akceptovatelné kvality práce s glukometrem.

K zabezpečení nezbytných analytických podmínek plně postačuje použití testovacích proužků (20).

Mez detekce glukózy v moči při použití testačních (diagnostických) proužků by se měla podle manuálu WHO (5) pohybovat kolem 5,5 mmol/l.

Je nutno zabránit bakteriální kontaminaci vzorků močí rychlým provedením analýzy, krátkou mimolaboratorní dobou odezvy, případně skladováním vzorků při 4°C. Oxidanty (peroxidové látky, chlornany) působí falešnou pozitivitu reakcí, reduktanty (zejména pak kyselina askorbová) falešnou negativitu.

7. Koncentrace ketolátek v moči a krvi (22, 23)

Stanovení ketolátek v krvi a moči má význam pro diagnózu diabetické ketoacidózy. Ketolátky mají být stanovovány u všech diabetických pacientů s hodnotou glukózy nad 16,7 mmol/l a též při výskytu klinických symptomů diabetické ketoacidózy. V krvi a moči jsou přítomny tři ketolátky: kyselina acetoctová, aceton a kyselina -hydroxymáselná (3-hydroxybutyrát). Klasické testovací proužky jsou však schopné detekovat pouze kyselinu acetoctovou a aceton (ketony), nikoliv kyselinu ß-hydroxymáselnou. Za normálního stavu jsou kyselina acetoctová a ß-hydroxymáselná přítomny v krvi a moči v ekvimolárních množstvích. Avšak při tkáňové hypoxii je kyselina acetoctová redukována na kyselinu –hydroxymáselnou a v důsledku toho klasické diagnostické proužky významně podhodnocují celkovou koncentraci ketolátek. Při diabetické ketoacidóze dochází ke tkáňové hypoxii, proto má pro její diagnózu mnohem větší význam stanovení kyseliny –hydroxymáselné než klasické stanovení ketolátek standardními diagnostickými proužky.

Falešně pozitivní výsledky při stanovení v moči mohou být způsobeny:

- silným zbarvením vzorků,

- některými léky (například inhibitory ACE),

- poškozením proužků nevhodným zacházením (expozice ovzduším, teplotou a pod.),

- lačněním nebo sníženým kalorickým příjmem (redukční diety),

- těhotenstvím (u asi 30 % případů).

 

Falešně negativní výsledky mohou být způsobeny:

- velmi nízkým pH moči,

- vysokým příjmem kyseliny askorbové,

- mikrobiálním rozkladem a následným únikem těkavého acetonu.

 

 

Při stanovení ketonů v krvi klasickými testovacími proužky nebo tabletami na bázi nitroprussidové barevné reakce není kyselina -hydroxymáselná detekována. Jsou však k dispozici metody určené přímo k měření kyseliny -hydroxymáselné v krvi. Měření se provádí alternativně v krvi, séru nebo plazmě. V případě použití plazmy používají různí výrobci různých antikoagulancií. V séru/plazmě je stabilita analytu 1 týden při 4 °C a několik týdnů, skladuje-li se vzorek při -20 °C. Validní data o analytických znacích metody a ukazatelích analytické kvality nejsou dosud k dispozici, nebo jsou kontroverzní.

- Stanovení ketonů v moči klasickými metodami není podloženo důkazy při diagnostice diabetické ketoacidózy ani k sledování jejího průběhu.

- Stanovení ketonů v krvi klasickými metodami lze použít v procesu diagnózy diabetické ketoacidózy, nikoliv však k sledování jejího průběhu.

- Stanovení kyseliny -hydroxymáselné lze doporučit jak k diagnostikování, tak ke sledování průběhu diabetické ketoacidózy, avšak případné výhody tohoto přístupu vůči tradičním metodám také nejsou dostatečně podloženy důkazy.

 

 

8. Glukózový toleranční test (OGTT)

Orální glukózový toleranční test se používá k potvrzení diagnózy diabetes mellitus v případě, že diagnóza není jednoznačně potvrzena nálezem glykemie nalačno vyšší než 7.0 mmol/l. Jde jednak o stavy s hraniční glykemií nalačno (IFG, 6.1-6.9 mmol/l), jednak v situacích s glykemií nižší než 6.1 mmol/l, při nichž bylo vysloveno podezření na poruchu tolerance glukózy z předchozích vyšetření nebo jedná-li se o jedince se zvýšeným rizikem vzniku diabetu. Při nálezu porušené glukózové tolerance (PGT) se OGTT opakuje ve dvouletých intervalech.

OGTT se dále používá v těhotenství u skupin se zvýšeným rizikem vzniku diabetu (viz Standardy péče o těhotné s diabetem). V tomto případě se test provádí ve 24.-28. týdnu gravidity.

Podle doporučení WHO lze OGTT doporučit jako doplňující diagnostickou zkoušku v případech, kdy se hodnota FPG pohybuje v  intervalu 6,1 - 7,0 mmol/l.

Doporučení ADA nepoužívá v diagnostice diabetu OGTT vůbec.

V obou případech však slouží OGTT k diagnóze gestačního diabetes mellitus.

Rozhodovací limit OGTT pro diagnózu diabetes mellitus je definován jako:

Hodnota plazmatické glukózy v žilní krvi ve druhé hodině po zátěži 11,1 mmol/l.

K vyslovení diagnózy musí být překročení tohoto rozhodovacího limitu potvrzeno opakovaně.

Doporučení WHO (5) používá k diagnostice gestačního diabetu stejného uspořádání OGTT a stejného rozhodovacího limitu jako při diagnóze diabetu 1. a 2. typu.

Diagnóza gestačního diabetu podle ADA (4) je založena na použití OGTT v modifikovaném provedení a s pozměněnými hodnotami rozhodovacích limitů.

K diagnostikování gestačního diabetu musí být překročeny aspoň dvě hodnoty uvedených rozhodovacích limitů.

Biologickým materiálem pro OGTT je plazma žilní krve. V plazmě kapilární krve je za běžných okolností stejná koncentrace glukózy jako v plazmě žilní krve. Avšak po zátěži glukózou činí rozdíl mezi plazmou kapilární a žilní krve až 20–25íce). Také mezi koncentracemi glukózy v plné krvi a v plazmě jsou významné (a výše již uvedené) diference. Uvedených hodnot rozhodovacích limitů nemůže být proto použito, je-li při OGTT použito plné žilní krve nebo materiálu získaného kapilárním odběrem. V dřívějších edicích dokumentů WHO byly hodnoty rozhodovacích limitů pro plnou krev a pro kapilární náběry publikovány, v současné době se od této praxe již upustilo.

Uvádí se, že reprodukovatelnost klasifikace diabetes mellitus pomocí jednoho provedení OGTT se pohybuje v rozmezí pouze 50–70čnění před odběrem po dobu 8–14 hodin, předchozí třídenní dieta se zvýšeným přísunem sacharidů v potravě v množství minimálně 150aktivita ve stejném období. Malabsorpce, nauzea a kouření ovlivňují výsledek OGTT. Snížení obsahu sacharidů v dietě sníží diagnostickou senzitivitu OGTT.

9. Ukazatele autoimunity a diagnostika diabetes mellitus

Tyto ukazatele nejsou ještě doporučovány jako nástroje rutinní diagnózy diabetes mellitus. Slouží zejména k vyhledávání vhodných dobrovolných dárců k provedení transplantace částí pankreatu pro indikované případy terapie diabetiků 1. typu.

Destrukce -buněk pankreatu diabetiků 1. typu je zprostředkována T-lymfocyty produkujícími tyto typy autoprotilátek:

- ICA (islet cell cytoplasm), protilátky cytoplasmy T-lymfocytů

- IAA (insulin autoantibodies), protilátky proti inzulinu

- Anti GAD 65 A (anti glutamic acid decarboxylase), protilátky proti dekarboxyláze kys.glutamové

- IA-2A, IA-2 A (insulinoma associated antigens)

Četnost výskytu autiprotilátek u nově diagnostikovaných diabetiků 1. typu je následující:

- ICA 80A 20ětí s diabetem 1. typu do věku 5 let a < 40

Klinická laboratoř stanovující autoprotilátky má být akreditována, má mít dobře vypracovaný program kontroly analytické kvality včetně úspěšné účasti v programu externího hodnocení kvality. Metodická standardizace k datu tohoto doporučení není zatím rozvinuta, ale intenzívně se na ní pracuje.

K dosažení potřebné úrovně klinické citlivosti a specifičnosti se doporučuje (25):

- dosažení specifičnosti nad 99%,

- dokumentace výsledků externího hodnocení kvality,

- kombinované použití všech autoprotilátek,

- sledování v čase.

Tento algoritmus však není obecně akceptovaný.

 

 

Diabetes mellitus se může sdružovat s tyreopatiemi v rámci tzv. sdružených autoimunit. Přítomnost tyreopatie pak případně může ovlivnit i stav jeho kompenzace. Vzhledem k často subklinickému průběhu je screening tyreopatií vhodný. U každého diabetika má být vyšetřen TSH a v případě diabetu 1. typu se provádí vyšetření protilátek proti tyreoglobulinu (anti TG) a proti tyroidální peroxidáze (anti TPO).

Riziko asymptomatické, němé formy céliakie je v populaci 1:200, u diabetes mellitus 1. typu, podobně jako u jiných autoimunitních onemocnění, je toto riziko 10x větší a popsaná incidence je 1:20.

Význam diagnostiky céliakie je doložen pozitivním efektem dodržování bezlepkové diety. Při dodržování bezlepkové diety klesá riziko malignit zažívacího traktu a dochází ke zlepšení kontroly i vlastního diabetu.

Doporučen je screening sérologickými markery céliakie (CD markery) - protilátky ke gliadinu IgA a IgG (AGA-A, AGA-G), protilátky k endomyziu IgA (EmA), protilátky ke tkáňové transglutamináze IgA (atTG-A). U dospělých je doporučen screening alespoň 1x ročně, u dětí je doporučován screening každé 2 roky.

Při pozitivitě tří ze čtyř CD markerů je doporučeno provedení biopsie tenkého střeva a histologické vyhodnocení, které je spolehlivým diagnostickým průkazem céliakie.

Senzitivita a specificita kombinace CD markeru dosahuje hodnot > 90 %.

Pro uvedené čtyři CD markery je zaveden systém kontroly kvality EQA.

10. Genetické ukazatele

Jejich určení nemá zatím prokázaný význam v rutinní diagnostice a v procesu kontroly terapie diabetes mellitus (26).

Detekce některých mutací HLA-DR/DQ souvisejících s některými diabetickými syndromy diabetu 1. typu může poskytnout cenné informace jak o stupni genetického rizika, tak o stupni protektivity individua pro diabetes 1. stupně. Cenné by mohlo být zejména zdokonalení identifikace allel souvisejících s MODY (maturity onset diabetes of youth) diabetem. Pět typů diabetu MODY je klasifikováno právě genetickými nástroji.

Materiálem pro detekci mutací jsou vzorky DNA získané z leukocytů krve. PCR je metodou volby, existuje však řada variant metodického postupu, aniž je dostatek údajů o jejich analytických znacích.

11. Doporučení ČSKB a ČDS o změně kalibrace hemoglobinu A_1c a referenčních mezí

Česká společnost klinické biochemie ČLS JEP (ČSKB) a Česká diabetologická společnost (ČDS) ČLS JEP ve spolupráci s Referenční laboratoří pro klinickou biochemii a na základě rozhodnutí Světové federace klinické chemie a laboratorní medicíny (IFCC, International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine) upozorňují, že s platností od 1. ledna 2004 se mění způsob kalibrace stanovení hemoglobinu A_1c a dochází ke změnám referenčních hodnot a rozhodovacích limitů.

a) Referenční meze zdravých dospělých osob podle nové kalibrace jsou 2,8 až 4,05% interval).

b) Kritéria kompenzace diabetu jsou uvedena v tabulce:

Připouští se vyjadřování v procentech (%) i ve zlomku z jedné (1,0). Jiné vyjadřování výsledků je v zásadním rozporu s návazností tohoto stanovení na mezinárodně doporučené postupy. Změna kalibrace za použití kalibrátoru IFCC je pro laboratoře závazná ke stejnému datu. Technicky je aplikace tohoto doporučení zajištěna dodavateli. Další informace jsou uvedeny v doporučení ČSKB Laboratorní diagnostika a sledování stavu diabetes mellitus, dostupném na www.cskb.cz.

1. Definition, Diagnosis and Classification of Diabetes mellitus and Its Complications. World Health Organisation 1999, WHO/NCD/NCS/ 99.2.

2. American Diabetes Association. Report of the Expert Committee on the Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus. Diabetes Care, 25, Supplement 1, January 2002 : S5-S20.

3. Sacks DB, Bruns DE, Goldstein DE, Maclaren NK a spol. Guidelines and Recommendations for Laboratory Analysis in the Diagnosis and Management of Diabetes Mellitus. Clin Chem 2002; 48: 436-472.

4. American Diabetes Assotiation. Clinical Practice Recommendations. Diabetes Care 2003; 26, Suppl 1, S1- S20.

5. Reinauer H , Home PD, Kanabasagapathy AS , Heuck C-Ch. Laboratory diagnosis and monitoring of diabetes mellitus. World Health Organization 2002.

6. Stahl M, Joergensen GM, Hyltoft Petersen P. Optimization of preanalytical conditions and analysis of plasma glucose. Scand J Clin Lab Invest 2001; 61;169 -180.

7. Burnett RW,D´Orazio P, Fogh-Andersen A, Kuwa K, Kulpmann WR,a spol. IFCC recommendation on reporting results for blood glucose. Clin Chim Acta 2001; 307: 205-209.

8. Fraser CG. Biological variation: From principles to practice.AACC Press 2001.

9. Jorgensen GM, Stahl M, Brandslund I, Hyltoft Petersen P, Borch-Johnsen K, De Fine Olivarius N. Plasma glucose reference interval in a low risk population. 2. Impact of the new WHO and ADA recommendations on the diagnosis of diabetes mellitus. Scand J Clin Lab Invest 2001; 61; 181-190.

10. prISO 15189.2 Quality management in the medical laboratory. ISO. Geneva 2002.

11. NGSP Steering Committee.Implementation of the national glycohemoglobin standardization program.Diabetes 1997; 46: 151A.

12. Little RR, Rohlfing CL, Wiedemayer HM, Myers GL, Sacks DB, Goldstein DE.The National Glycohemoglobin Standardization Program (NGSP)- a five-year progress report. Clin Chem 2001;47:1985-992.

13. Joergensen LGM, Branslund I, Stahl M, Hyltoft Petersen P, Iversen S et.al. Upper reference limit, analytical quality specifications and clinical use of haemoglobin A1c. Scand J Clin Lab Invest 2002; 62: 609-622.

14. Kobold U, Jeppson JO, Dulffer T, Finke A, Hoelzel W, Miedema K. Candidate reference methods for hemoglobin A1c based on peptide mapping. Clin Chem 1997; 43:1944-1951.

15. Weitgasser R, Gappmayer P, Pichler M. Newer portable glucose meters- analytical improvement compared with previous generation devices? Clin Chem 1999; 45:1821-1825.

16. American Diabetes Association. Consensus statement on self-monitoring of blood glucose. Diabetes Care 1987; 10: 93-99.

17. National Committee for Clinical Laboratory Standards.Ancillary (bedside) blood glucose testing in acute and chronic care facilities. Approved guideline C30-A 1994; 14:1-14. NCCLS, Villanova, PA.

18. In vitro diagnostic test systems-Requirements for blood-glucose monitoring systems fot self-momitoring in managing diabetes mellitus. ISO/DIS 15197-2. International Organization for Standardization 2002.

19. American Diabetes Association. Diabetes Nephropathy. Diabetes Care 1999; 22 (Suppl 1): S66-S69.

20. Kouri T, Fogazzi G, Gant V, Hallander H, Hofmann W, Guder WG.: European Urinalysis Giudelines. Scand J Clin Lab Invest 2000; vol. 60; Supplement 231 1-96.

21. Poulsen PL, Hansen B, Amby T, Terkelsen T, Mogensen CE. Evaluation of dipstick test for microalbuminuria in three different clinical settings including the correlation with urinary albumin excretion rate. Diabetes Metab 1992; 18: 395-400.

22. Porter WH, Yao HH,Karounos DG. Laboratory and clinical evaluation of assays for -hydroxybutyrate.Am J Clin Pathol 1997; 107: 353-358.

23. American Diabetes Association. Test of glycemia(Position Statement). Diabetes Care 2000; 23 (Suppl 1): S80-S82.

24. Ko GT,Chan JC,Woo J, Lau E, Yeung VT a spol. The reproducibility and usefulness of the oral glucose tolerance test in screening for diabetes. Ann Clin Biochem 1998; 35: 62-67.

25. Atkinson MA, Eisenbarth GS. Type 1diabetes: new perspectives on disease pathogenesis and treatment. Lancet 2001; 358: 21-229.

26. Klein J, Sato A. The HLA system. First of two. A Engl J Med 2000; 343: 702-709.

27. Monitoring glycaemic control in the diabetic patient. Ed. W Garry John IFCC Series. Excerpta Medica Publications, London, 2002